紫山药抗性淀粉调节高脂血症金黄地鼠脂质代谢（一）

高脂饮食可导致血脂升高，紫山脂血症金质代严重时可引起一些危害人体健康的药抗疾病，如动脉粥样硬化、性淀谢冠心病和胰腺炎等，粉调已成为现代社会人群主要的节高营养问题之一。此外，黄地长期食用高脂膳食还可导致体脂异常积累和肠道微生物群的鼠脂不平衡。通过饮食干预预防由高脂饮食引起的紫山脂血症金质代健康问题正成为研究的热点。

抗性淀粉在小肠中难以被酶解吸收，药抗而在大肠中可被酵解，性淀谢其通过上消化道进入大肠，粉调经细菌发酵产生短链脂肪酸，节高调节肠道菌群，黄地降低血糖和胆固醇，鼠脂抑制脂肪的紫山脂血症金质代吸收积累，改善慢性炎症。盲肠是大肠的起始段，虽然盲肠、结肠是细菌最密集和多样的区域，且二者内容物中菌群结构具有相似性，但是优势菌群存在差异。目前关于盲肠中菌群变化特征与改善因高脂饮食诱导高血脂和高血糖关系的研究少有报道。紫山药（PurpleDioscoreaalataL）为多年生藤本植物薯蓣（DioscoreaalataL）的块茎，在我国南方地区广泛种植，淀粉约占生物总量的16%～20%。

本研究以紫山药高抗性淀粉为原料，揭示紫山药高抗性淀粉对盲肠微生物的益生作用及其改善高血脂症效能，可为盲肠菌群及脂质代谢与健康的研究提供依据。

1材料和设备

1.1材料与试剂

紫山药（紫玉淮山），产自福建省三明市建宁县。普鲁兰酶（2800U/g）、高温α-淀粉酶（8000U/mL），美国Sigma公司；淀粉葡糖苷酶（100000U/mL），上海麦克林生化科技有限公司；D-葡萄糖检测试剂盒，爱尔兰Megazyme公司；血脂试剂盒，南京建成生物工程研究所；ＴIANampStoolDNAkit试剂盒，天根生化科技有限公司；柠檬酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、无水乙醇均为国产分析纯。基础饲料成分：碳水化合物72.3%、蛋白质14.9%、脂肪12.8%；高脂饲料成分：氢化椰子油5%，玉米油5%，胆固醇0.2%和基础饲料89.8%。饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

1.2主要设备与仪器

DHG-9003A型热风干燥箱，上海精宏试验设备有限公司；SYQ-DSX-280B型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ＴDL-5-A型低速离心机，上海安亭科学仪器厂；ＶERＴEX70型傅里叶红外光谱仪，德国布鲁克分析仪器公司；GA-3型血糖仪，三诺生物传感股份有限公司；CFX96型荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；PE300型IlluminaMiSeq测序仪，美国Illumina公司。

2试验方法

2.1紫山药抗性淀粉的制备

紫山药淀粉的制备见文献。将50.0g紫山药淀粉（干基），加至200mL磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH5.0）中煮沸30min，降温至58℃；加入普鲁兰酶（2800U/g）搅拌12h；调节至7.0，120℃保温30min，冷却至4℃贮藏24h，反复2次；将沉淀粉40℃干燥后，称取20.0g加入100mLpH6.0乙酸钠缓冲溶液，升温至90℃，加入0.3mL高温α-淀粉酶（8000U/mL）保持1h，冷却至60℃并用稀释的柠檬酸调节pH至4.5，加入0.3mL淀粉葡糖苷酶（100000U/mL）保持1h；以3000×g离心15min，蒸馏水洗涤淀粉3次，体积分数95%乙醇洗涤3次，40℃干燥24h，粉碎过100目筛，得高抗性淀粉（HRS）。经检测，HRS中的快速消化淀粉、缓慢消化淀粉和抗性淀粉的含量分别为11.4%，28.4%和60.2%。

2.2 FTlR分析

傅里叶变换红外光谱（FＴIR）分析根据Wang等的方法稍做修改。将干燥的HRS样品与溴化钾以1∶100～1∶150的比例进行混合，充分研磨。将研磨好的粉末倒入模具中抽真空压片，12MPa的压力下保持30s，压至透明，在4000～400cm^-1扫描范围内利用傅里叶变换红外光谱扫描仪观察。

2.3动物模型建立

雄性金黄地鼠，SPF级，6～8周龄，体重90～110g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。适应性喂养1周后，将32只金黄地鼠随机分为4组饲喂：正常对照组（NC）：基础饲料+等量生理盐水；模型组（MC）：高脂饲料+等量生理盐水；HRS低剂量组（LR）：高脂饲料+0.5g/100gbw高抗性淀粉；HRS高剂量组（HR）：高脂饲料+1.5g/100gbw高抗性淀粉。金黄地鼠自由采食、饮水，10h/14h白昼交替喂养4周。

2.4盲肠内容物收集

在第2和第4个周末禁食12h，各试验组分别宰杀3只和5只金黄地鼠，收集盲肠内容物包装后于-80℃冷冻。

2.5血清指标测定和脏器变化

在第4周末眼眶取血后处死，快速剥离肝脏、肾脏、脾脏、附睾和肾周的脂肪组织并称重；将血液收集在采血管中，于4000r/min、4℃离心15min，血清分装在1.5mL离心管中，于-20℃保存备用；按照血脂测定试剂盒说明书测定甘油三脂（ＴG）、总胆固醇（ＴC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度。

2.6 DNA提取和16SrDNA基因PCR扩增

使用ＴIANampStoolDNAkit试剂盒从金黄地鼠盲肠内容物中提取DNA。以盲肠内容物中细菌基因组为模板，以520F和802R为上下游引物，扩增16SrDNA的Ｖ4区。其中，PCR反应体系（50μL）：10×Ｔaqbuffer5μL；dNＴP5μL；上游引物515F（20μmol/L）0.5μL；下游引物806R（20μmol/L）0.5μL；Ｔaq酶0.5μL；模板1μL；ddH2O37.5μL。PCR反应条件：94℃3min；94℃45s，50℃60s，72℃90s，35个循环；72℃10min。

2.7测序数据的生物信息分析

采用Illumina公司的ＴruSeqNanoDNALＴLibraryPrepKit制备测序文库，在IlluminaMiseq测序仪上进行测序；将测序条带拼接，按照与参照序列≥97%的相似度聚类，建立OＴU，并确定种系型。利用热图和分类组成分析（LEfSe分析）分别研究金黄地鼠盲肠菌群丰度和分类组成的变化。

2.8统计分析

所有检测一式3份，采用DPS8.0软件包进行统计学分析。结果表示为：平均值±标准偏差。方差分析按5%显著性水平进行。

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